Cepas de hongos – Almacenamiento con nitrógeno líquido

tubo ensayo nitrogeno liquido setas cepas conservacion hongosEs el mejor método de almacenamiento a largo plazo porque el crecimiento micelial es completamente detenido a -196° C. Este método mantiene viable un cultivo madre por muchos años. Solamente los cultivos de más alta calidad se deben seleccionar para un almacenamiento a largo plazo.

El almacenamiento de cepas en nitrógeno líquido es muy bueno, pero caro. Los costos iniciales por adquisición de equipo son altos y el nitrógeno líquido es un gasto constante cada mes. La unidad de almacenamiento de nitrógeno requiere un constante monitoreo para ver el nivel de nitrógeno en la cámara.

Este método involucra el llenado de un cryotubo (tubo especial diseñado para uso de nitrógeno líquido) con un cryoprotector y sumergir en él algunos trozos de agar o granos de semilla. Los cryotubos llenos son entonces colocados en una caja dividida o en una “caña” antes de almacenarlos en la cryo-unidad. El propósito del cryoprotector es minimizar el daño a las células durante el ciclo de enfriamiento y congelación. Hay muchos cryoprotectores, pero el más popular es el que se prepara con 10% de glicerol en agua. Se mezcla 1 ml de glicerol en 9 ml de agua destilada en un tubo con tapa de rosca y se esteriliza en autoclave por 15 minutos a 121° C.


hongo papel filtroEl enfriamiento inadecuado dañará el micelio del hongo y puede llegar a perderse la cepa. Para evitar esto, los cultivos deben ser enfriados cuidadosamente; es decir, antes de colocar los cryoviales en la unidad (termo) de nitrógeno líquido, se debe descender la temperatura de éstos a una velocidad controlada de -1° C/min durante 4 horas, hasta alcanzar una temperatura de -70° C. Las unidades de enfriamiento lento de nitrógeno líquido son muy caras, por lo que una alternativa de bajo costo es usar un contenedor cryogénico de enfriamiento a tasa controlada (figura 28), los cuales están disponibles en los catálogos de proveedores científicos .

Los cryoviales son colocados en un contenedor de enfriamiento que se suspende en alcohol isopropílico, y la unidad entera es colocada en un refrigerador a -70° C. La única propiedad que tiene el alcohol isopropílico es que a -70° C desciende su temperatura a una tasa de 1° C/min, con lo cual se consigue la velocidad requerida de enfriamiento. Después de cuatro horas, los cryotubos congelados son almacenados en el termo de nitrógeno líquido . Los cryotubos son etiquetados con un cryomarcador especial, porque de otra manera la etiqueta desaparecería al sumergirse en el nitrógeno líquido.

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Para recuperar una cepa, el cryotubo es sumergido en un baño maría a 37° C por uno o dos minutos. Una vez descongelado, el contenido del cryotubo es vaciado en una placa de APDL. Los trozos de agar son colocados en el centro de la placa con una aguja y la placa es inclinada para permitir que el cryoprotector escurra del micelio. La placa debe ser revisada uno o dos días después para verificar la pureza y la apariencia.

Cuando se usa nitrógeno líquido (-196° C), se debe seguir la técnica adecuada para evitar accidentes serios. Por ejemplo, si el nitrógeno escurre dentro de un cryotubo durante el almacenamiento, el vial puede explotar cuando se coloque en el agua para descongelarlo. Por esto, se deben usar guantes y una máscara protectora durante el llenado de la cámara o al extraer y descongelar los cryoviales.

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